Диагностика миодистрофии Дюшенна в России: проблемы, достижения, возможности

Миодистрофия Дюшенна – наиболее часто встречающееся X-сцепленное нейромышечное заболевание. С ним рождается приблизительно 1 из 3500-5000 мальчиков. Клинически заболевание видят только в 5-7 лет. Но при настороженности семьи и врачей диагноз можно заподозрить еще до года, что важно для своевременного начала проведения патогенетической терапии заболевания.

Спектр мутаций самого большого гена

Если бы гены человеческого организма соревновались по своей значимости, то приз за размер на уровне ДНК точно присудили бы гену дистрофина. Его размер составляет около 2,5 миллионов нуклеотидных пар, он насчитывает 79 экзонов. От гена дистрофина напрямую зависит работа мышц, поскольку функционально неактивный или частично функционально активный дистрофин приводит к разрушению мышечных волокон.

«Мутации в гене дистрофина ассоциированы не только с миодистрофией Дюшенна, но и с миодистрофией Беккера и дилатационной кардиомиопатией. Если пациент пришел к неврологу, то ему поставят диагноз «мышечная дистрофия Дюшенна/Беккера». А если — к кардиологу, потому что у него уже возникли какие-то проблемы с сердцем, то поставят диагноз «дилатационная кардиомиопатия». Мне кажется, эти формы разделяют по преобладающей клинике по тому, к какому врачу впервые обратился пациент», — отметил в своем выступлении Александр Поляков, доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАН, заведующий лабораторией ДНК-диагностики Медико-генетического научного центра им. ак. Н.П. Бочкова.

По данным регистра The TREAT-NMD DMD Global (на изображении) наиболее распространёнными мутациями остаются крупные делеции одного и более экзонов — 68%, крупные дупликации одного и более экзонов – 11%, различные малые точковые мутации в сумме составляют 11%.

Рамка считывания гена и фенотип миодистрофии

Как правило, делеция со сдвигом рамки считывания приводит к миодистрофии Дюшенна, а без сдвига рамки считывания – к миодистрофии Беккера (МДБ менее выраженный фенотип по сравнению с МДД). Эта статистика верна для 90% пациентов с МДД и 82% пациентов с МДБ. Если происходит делеция без сдвига рамки считывания («инфрейм»), то в 78% случаев у пациентов подтверждается Беккер, в 22% — Дюшенн. Дупликации в этом смысле несколько менее предсказуемы.

Что дает молекулярная диагностика

При мутации в других генах возникают состояния, похожие на мышечную дистрофию Дюшенна/Беккера. Но они наследуются не X-сцепленно, а рецессивно. Такое бывает, например, при поясно-конечностной мышечной дистрофии. Клинически эти виды практически неотличимы и врач не сможет сразу определить заболевание. Постановке диагноза помогает молекулярная диагностика. Она позволит установить молекулярную причину заболевания, выявить мутировавший ген и определить тип мутации. Только после этого можно назначить патогенетическую терапию.

При проведении прямой диагностики в первую очередь рассматриваются делеции и дупликации в гене дистрофина. При их отсутствии идет поиск точковых мутаций и патогенных вариантов в некодирующих и регуляторных участках гена.

Золотым стандартом анализа протяженных мутаций, позволяющего посмотреть все 79 экзонов, остается мультиплексная лигазная реакция (MLPA) и хромосомный микроматричный анализ (ХМА). ХМА дороже, и его назначают, только если нужно определить, изолированное ли это заболевание в семье или у пациента какой-то порок/синдром. В результате ХМА можно выявить изменения и в других генах.

Точковые мутации исследуются секвенированием (определением последовательности нуклеотидов) гена дистрофина. Если раньше проводили секвенирование по Сэнгеру, теперь используется секвенирование следующего поколения (NGS) — для его проведения достаточно исследовать панель гена.

Варианты в некодирующих регионах рассматриваются, когда у пациента Х-сцепленное наследование, присутствует несколько больных в семье и при этом секвенирование экзонов ничего не дало. Для этого в лаборатории либо секвенируют геном, либо проводят анализ на уровне мРНК.

«Такие исследования доступны не только в Европе, но и в России. И не только в Москве. Оборудование в российских лабораториях абсолютно такое же, как в лабораториях Европы, США. Но в нашей стране анализ стоит в 10 раз дешевле, если пересчитать на валютный курс, чем в Европе. Уже три года ФБГНУ МГНЦ реализует для россиян бесплатную программу селективного скрининга на МДД. Программа диагностики доступна и для постсоветского пространства – для всех республик, кроме Украины и стран Прибалтики. В программу включаются только мальчики с предположительным клиническим диагнозом «миодистрофия Дюшенна/Беккера» или с резко повышенным уровнем КФК», — поделился профессор Александр Поляков.

Основные требования для вхождения в программу опубликованы на сайте Центра (раздел Медицинские услуги/Бесплатные программы). Кроме того, врач может самостоятельно обратиться на прямую горячую линию (8(800)100-17-60) и включить своего пациента в программу.

Разновидности патогенетической терапии

Терапия при МДД направлена на сохранение самостоятельного передвижения, замедление прогрессирования заболевания и поддержание респираторной функции с целью отсрочить необходимость подключения пациента к аппаратам респираторной поддержки. Для этого в настоящее время применяются варианты терапии, специфичные для определенных мутаций, включающие пропуск экзонов и пропуск считывания преждевременных стоп-кодонов. Эти две стратегии подходит для ~ 47% российских пациентов с мутациями в гене дистрофина. Параллельно разрабатывается генозаместительная терапия, благодаря которой можно будет добавить в ядра мышечных клеток искусственную матрицу для синтеза дистрофина.

Пропуск экзонов позволяет восстановить рамку считывания мРНК за счет увеличения размера делеций на один экзон. Но этот метод подходит только пациентам с определенными типами делеций в гене дистрофина. Зная делецию пациента, врачи могут точно сказать, подходит ли ему какой-то из существующих препаратов пропуска экзонов. Это можно сделать с помощью специальных таблиц на сайтах: ParentProjectMuscularDystrophy, CureDuchenne или с помощью инструмента Exon deletion tool на Duchenne. Приблизительно 30% пациентам подходит один из существующих препаратов пропусков экзонов.

Пропуск преждевременно образованных стоп-кодонов позволяет восстановить синтез белка нормальной длины, заблокированный в результате нонсенс-замены. Этот метод используется, если стоп-кодон возник в результате однобуквенной точковой замены. Он подходит пациентам с нонсенс-мутациями. Для пропуска преждевременно образованных стоп-кодонов используют специальные лекарственные препараты (например, «Аталурен», зарегистрированный в РФ). Метод позволяет вставить аминокислоту, чтобы синтез белка пошел дальше. В результате применения этого метода у пациента синтезируется практически полноценный дистрофин. Пациентов, которым подходит Аталурен, — более 17%.

Генозаместительная терапия подходит пациентам с любым типом мутаций в гене дистрофина. Её цель – восстановить синтез белка путем заместительной терапии. Все экспериментальные препараты генозаместительной терапии в настоящее время находятся на стадии разработки и исследования. Сразу несколько фармацевтических компаний исследуют возможность использования вирусного вектора, чтобы доставить в клетку укороченную версию гена дистрофина («мини» или «микро»). Сложность в том, что целиком вместить в вектор такой длинный ген невозможно. Поэтому средние экзоны дистрофина из стержневого домена искусственно вырезаются. И его уже можно вставить в определенные типы вирусных векторов.